Conditions de l’AMP en France :
"Au regard de la loi française, les techniques d’AMP sont considérées comme des thérapeutiques destinées à pallier l’infertilité pathologique d’un couple, médicalement constatée, ou à eviter un risque de transmission d’une maladie. Elle est, à ce titre, prise en charge par l’assurance maladie française.Elle est réservé à des couples engagés dans un projet parental, mariés ou en mesure d’apporter la preuve d’une vie commune de plus de 2 ans, formés d’un homme et d’une femme, tous deux vivants et en age de procréer.
L’AMP n’est donc pas envisagée, en France, comme un mode de procréation alternatif, succeptible de pallier les impossibilités de procréer au sens large, qu’elles soient physiologiques ou sociales (couples dont la femme est menopausée, femmes célibataires, femmes homosexuelle), dans une logique d’aide à la parentalité »In « le bilan d’application de la loi de bioéthique du 6 août 2004 – Les points clés – Agence de Biomédecine, Mars 2009)
Texte "cotation des actes médicaux" : J.O. du 30/03/2005 Texte officiel :ASSISTANCE MÉDICALE À LA PROCRÉATION Facturation:"les actes du sous-chapitre 09.02 ASSISTANCE MÉDICALE À LA PROCRÉATION ne peuvent pas être remboursés au-delà du jour du 43e anniversaire.- une seule insémination artificielle par cycle peut être remboursée avec un maximum de 6 pour l’obtention d’une grossesse;- 4 tentatives de fécondation in vitro (fiv, icsi) peuvent être remboursées pour l’obtention d’une grossesse.- une demande d’entente préalable globale doit être déposée avant le début du traitement avec mention de la technique utilisée;- si cette technique change, le contrôle médical doit être informé;Dans le cadre des actes remboursés,La partie biologique de l'AMP (laboratoire) est prise en charge entièrement (en dehors des techniques d'IMSI).
En revanche,de nombreux gynécologues, essentiellement du secteur privé, pratique un "dépassement d'honoraires" qui n'est pas pris en charge par la sécurité sociale. Il faut donc se renseigner auprès de sa mutuelle complémentaire pour connaître leur position vis à vis de ces "surcoûts" non prévus par la nomenclature des actes médicaux.
ARRETE DU 25 JANVIER 2000 MODIFIANT L'ARRETE DU 3 AVRIL 1985 FIXANT LA NOMENCLATURE DES ACTES DE BIOLOGIE MEDICALE (NABM)Arrêtent :Art. 1er - A la deuxième partie de la Nomenclature des actes de biologie médicale, le chapitre III est supprimé et remplacé par :CHAPITRE IIIAssistance médicle à la procréation (AMP)Les actes du présent chapitre doivent être réalisés conformément aux conditions prévues dans le guide de bonne pratiques cliniques et biologiques en assistance médicale à la procréation approuvé par arrêté du 12 janvier 1999 (JO du 28 février 1999).I - Actes de biologie interventionnelle à visée thérapeutiqueConditions de prise en charge par l'assurance maladie de l'exploration et du traitement de la stérilité conjugaleAge de la femme : la prise en charge s'interrompt au jour du 43e anniversaire de la femme.
Nombre d'actes :1° Pour l'insémination artificielle : il ne peut être coté qu'une insémination par cycle pendant 6 cycles pour l'obtention d'une grossesse ;2° Pour une fécondation in vitro avec ou sans micromanipulation (actes n°s 0060 et 0061) : il ne peut être coté que quatre tentatives pour l'obtention d'une grossesse. On entend par tentative toute ponction ovocytaire suivie de transferts embryonnaires.
(ce qui doit vouloir dire qu'une tentative - au singulier dans le texte - peut avoir plusieurs transferts - au pluriel dans le texte - (a cause des embryons congelés) : un transfert d'embryons décongelés peut donc être interprété comme le prolongement de la tentative mais n'est pas une nouvelle tentative puisqu'il n'y a pas ponction ovocytaire.)
En cas de grossesse suivie de la naissance d'un enfant vivant, les actes mentionnés ci-dessus (1 et 2) peuvent être de nouveau pratiqués dans les limites prévues.Le biologiste est informé par le médecin de la date du dépôt de la demande d'entente préalable, qui est déposée par le médecin avant la réalisation du premier acte et vaut pour la totalité des actes (6 pour une insémination artificielle et 4 pour une fécondation in vitro).
NABM :
0059 Préparation des spermatozoïdes en vue d'insémination artificielle intra-utérine (IIU)............B 200
Préparation de spermatozoïdes congelés.
Cet acte comprend la fourniture et le contrôle du cathéter ainsi que le matériel isotherme de transport. Cet acte ne peut être réalisé que si antérieurement a été réalisé un test de migration-survie (test de séparation des spermatozoïdes - acte 0075) dont les résultats sont conformes aux normes prévues par le guide de bonne pratiques cliniques et biologiques en assistance médicale à la procréation approuvé par arrêté du 12 janvier 1999.
Cotation non cumulable avec celle des examens 5205, 0070 et 0075.
Prise en charge d'un acte par cycle pendant six cycles.
Les préparations de spermatozoïdes pour inséminations intracervicales ne sont pas prises en charge.
0060 Fécondation in vitro sans micromanipulation....................................................................B 1550
Cet acte ne peut être réalisé que si antérieurement a été réalisé un test de migration-survie (test de séparation de spermatozoïdes - acte 0075) dont les résultats sont conformes aux normes sprévues par le guide de bonnes pratiques cliniques et biologiques en assistance médicale à la procréation approuvé par arrêté du 12 janvier 1999.
Cet acte comprend la culture ovocytaire, la préparation des spermatozoïdes, l'insémination in vitro, le contrôle de la fécondation, la culture embryonnaire quelle que soit sa durée, la fourniture, la préparation et le contrôle du cathéter de transfert.
Lorsqu'une éclosion assistée est pratiquée, elle est incluse dans la cotation.
Cotation non cumulable avec celle de l'acte 0059 et 0061.
0061 Fécondation in vitro par micromanipulation (ICSI)............................................................B 2600
Cet acte ne peut être réalisé que dans les indications prévues par le guide de bonne pratiques cliniques et biologiques en assistance médicale à la procréation approuvé par arrêté du 12 janvier 1999.
Cet acte comprend les mêmes éléments que la FIV auxquels s'ajoute la micromanipulation des gamètes.
Cotation non cumulable avec celle des actes 0060 et 0059.
0062 Préparation des spermatozoïdes obtenus par ponction testiculaire ou épididymaire ou biopsie testiculaire en vue d'ICSI.......................................................................................................................................B 500
La cotation de l'acte est cumulable avec celle d'une ICSI.
Cotation non applicable après congélation des spermatozoïdes.II - Actes impliquant la congélation et la cryoconservation des gamètes et des embryons
0054 Congélation d'embryon(s) par cycle de FIV avec ou sans micromanipulation quels qu'en soient le nombre et le stade de développement de l'embryon...........................................................................................B 350
0063 Décongélation d'embryon(s) par cycle, quel que soit le nombre d'embryons.....................B 150
Cet acte comprend la fourniture, la préparation et le contrôle du cathéter de transfert.
0064 Cryoconservation d'embryon(s) par cycle de congélation par année au-delà de la première année et pour une durée de cinq ans............................................................................................................................B 150
0065 Congélation de sperme au cours d'une AMP ou en vue d'une autoconservation associée à un traitement stérilisant à visée thérapeutique par éjaculat avec au maximum quatre éjaculats par patient....B 350
0066 Cryoconservation de sperme associée à un traitement strérilisant à visée thérapeutique par patient, par année au-delà de la première année.............................................................................................................B 150
0067 Congélation, en vue d'une autoconservation pour ICSI, de spermatozoïdes prélevés chirurgicalement par patient et par séance...........................................................................................................................B 350
Acte pouvant être réalisé uniquement en vue d'une fécondation in vitro par micromanipulation.
Cotation de l'acte cumulable avec celle de l'acste (0062) de traitement des spermatozoîdes obtenus par prélèvement chirurgical en vue d'ICSI.
0068 Cryoconservation de spermatozoïdes prélevés chirurgicalement en vue d'une ICSI par patient, par année au-delà de la première année......................................................................................................................B 150
Ces spermatozoïdes cryoconcervés doivent être utilisés au cours d'ICSI avant tout nouveau prélèvement chirurgical de spermatozoïdes.
Dans le cas contraire, la cryoconservation n'est plus prise en charge.
Art. 2 Les dispositions du présent arrêté entrent en vigueur à l'issue d'un délai d'un mois, de date à date, comptant du jour de sa publication au journal officiel de la République Française. - Fait à Paris le 25 janvier 2000.
COTATIONS OFFICIELLES en Euros
Cotations " actes biologiques de la reproduction - ( source NABM)
(B = 0,27 €)
0060 - FECONDATION IN VITRO SANS MICROMANIPULATION (FIV) AVEC PREP.SPERMATO
B1550 = 418,5 €**
0061 - FECONDATION IN VITRO PAR MICROMANIPULATION (ICSI)
B2600 = 702 €**
0059 - PREPARATION DES SPERMATOZOIDES EN VUE D'IIU (INSEMINATION INTRA-UTERINE)
B200 = 54 €
0062 - PREPARATION DES SPERMATOZOIDES OBTENUS PAR PONCTION OU BIOPSIE EN VUE ICSI
B500 = 135 €
0054 - CONGELATION D'EMBRYONS ( PAR CYCLE)
B350 = 94,5 €
0063 - DECONGELATION D'EMBRYON (PAR CYCLE) + CATHETER
B150 = 40,5 €
0064 - CRYOCONSERVATION D'EMBRYON(S) (PAR CYCLE ET PAR ANNEE)
B150 = 40,5 €
0065 - CONGELATION DE SPERME... (PAR EJACULAT)
B350 = 94,5 €
0066 - CRYOCONSERVATION DE SPERME (PAR PATIENT, PAR ANNEE)
B160 = 43,2 €
0067 - CONGELATION DE SPERMATOZOIDES PRELEVES CHIRURGICALEMENT EN VUE ICSI(PAR PATIENT)
B350 = 94,5 €
0068 - CRYOCONSERVATION DE SPERMATOZOIDES PRELEVES CHIR. EN VUE ICSI(PAR PATIENT, ANNEE)
B150 = 40,5 €
Cotations "actes cliniques de la reproduction" - ( source CCAM)
YYYY032 : Induction de l'ovulation par gonadotrophines suivie d'une insémination artificielle ou d'une fécondation in vitro
61,44 €
JSLD002: Insémination artificielle intracervicale
38,4 €
JSLD001 : Insémination artificielle intra-utérine
38,4 €
JJFJ001 : Prélévement d'ovocytes sur un ou deux ovaires, par voie transvaginale avec guidage échographique
85,69 €
JHFB001 : Prélèvement de spermatozoïdes au niveau du testicule, de l'épididyme ou du conduit défèrent, par voie transcutanée
78,42 €
JSED001 : Transfert intra-utérin d'embryon, par voie vaginale
52,25 €
COUT REEL DES TECHNIQUES les plus courantes en AMP Ces coûts ne tiennent pas compte des frais engendrés par l'exploration clinico-biologique des conjoints avant derentrer dans la procédure même d'AMP
IAC
FIV / ICSI
FIV
Prix 2007 - sous réserve de fluctuations des facteurs variables:- Type de traitement- Dépassement d'honoraires (secteur II, cliniques)- IMSI
700 - 1200 €
3300 - 4500 €voir rubrique3500 - 4700 €
3100 - 4100 €
Ces prix s'entendent hors frais de déplacement et hors arrêt de travail et sont calqués sur le tarif "sécurité Sociale" hors dépassement d'honoraires qui peuvent varier considérablement d'un praticien à l'autre dans le secteur privé (se renseigner dans votre centre avant de prendre une décision, en principe la tarification des actes et des dépassement en secteur II est affichée en salle d'attente).** Protocole de traitement AMP sans traitement particulier du sperme (sperme frais, non prélevé) avec Analogue de la LHRH et HMG ou FSH.
Prix comparatifs de quelques médicaments rentrant dans les traitements de stimulation en vue d'AMP :Attention ces prix sont "bruts" et ne tiennent pas compte des modalités d'utilisation ni des spécificités médicales :Les prix peuvent varier d'un pays à l'autre et ne sont là qu'à titre indicatif pour les patientes qui ne rentrent pas dans un cadre local de remboursement par des organismes sociaux en France.
*Références : prix en France 01/2008 ** Applicables en 2009
Stimulations folliculaires :Décapeptyl ® : 4 à 6 €/jour suivant le mode d'administration (effet immédiat ou retard)Gonal-F ® : 0,40-0,45 € l'unité (UI) suivant le mode d'administrationPuregon ® : 0,40-0,45 € l'unité (UI suivant le mode d'administration)Menopur ® : 0,30 € l'unité (UI)Fostimon ® : 0,25 € l'unité (UI)Déclenchement de l'ovulation :Ovitrelle : 1 injection déclenchante : 41 €HCG 5000 : 1 injection déclenchante : 6 €
LA SOURCE: FIVFRANCE.COM
Sunday, January 22, 2012
Sunday, November 9, 2008
Le premier "bébé éprouvette a 30 ans
Le 25 juillet 1978, la naissance de Louise Brown, le premier "bébé éprouvette", faisait la Une dans le monde entier. La jeune Britannique entend fêter dans la discrétion son 30e anniversaire, ce vendredi.
A son grand regret, Louise Brown reste l'objet de de toutes les attentions, alors qu'elle mène aujourd'hui, avec son mari Wesley Mullinder et leur fils de 18 mois Cameron, une vie ordinaire à Bristol, dans le Sud-ouest de l'Angleterre, où elle travaille dans une entreprise de transport.
Sa naissance a révolutionné le traitement de la stérilité, permettant à des millions de couples dans le monde de procréer par fécondation in vitro (FIV), mais la jeune femme renâcle à l'idée de célébrer trop ostensiblement l'événement.
"Je n'y pense pas vraiment comme à mon 30e anniversaire, a-t-elle expliqué. Je fais juste comme si c'était un anniversaire normal. Je sortirai peut-être avec des amis ou je dînerai avec ma famille. Mais ça restera tranquille."
Louise Joy Brown est née par césarienne le 25 juillet 1978 à l'hôpital d'Oldham, au nord-ouest de l'Angleterre. Elle pesait 2,61 kg.
Depuis neuf ans, ses parents Lesley et John essayaient d'avoir un enfant. Mais toutes leurs tentatives avaient jusque-là échoué, parce que les trompes de Fallope de Lesley étaient obstruées.
Ils entendent alors parler des travaux de deux médecins de l'université de Cambridge, le physiologiste Robert Edwards et le gynécologue Patrick Steptoe, qui depuis près de dix ans tentent de perfectionner la technique de la fécondation in vitro.
Les deux chercheurs réunissent en éprouvette des ovules et spermatozoïdes de Lesley et John Brown, obtenant un embryon qui est réimplanté dans l'utérus maternel pour donner naissance au premier "bébé éprouvette".
AFP
Le 26 juillet 1978, Louise Brown, le premier "bébé éprouvette" naît par césarienne à l'Hôpital général du district de Oldham dans le nord-ouest de l'Angleterre.
Une enfance normale
Louise Brown n'a appris comment elle avait été conçue qu'à l'âge de 4 ans, avant d'entrer à l'école. "Papa et maman m'ont montré la vidéo de ma naissance et ont essayé de m'expliquer", se remémore-t-elle.
"Je pense que c'était juste au cas où les enfants à l'école sauraient, parce que les enfants peuvent parfois être très cruels", ajoute-t-elle. De fait, "les enfants avaient l'habitude de poser des questions comme: 'Comment est-ce que tu as tenu dans cette éprouvette?'", et d'autres du même genre."
Elle affirme avec insistance qu'elle a vécu une enfance des plus normales, "semblable à celle de n'importe quel autre enfant". Louise n'était plus unique. Pas même dans sa propre famille
A son grand regret, Louise Brown reste l'objet de de toutes les attentions, alors qu'elle mène aujourd'hui, avec son mari Wesley Mullinder et leur fils de 18 mois Cameron, une vie ordinaire à Bristol, dans le Sud-ouest de l'Angleterre, où elle travaille dans une entreprise de transport.
Sa naissance a révolutionné le traitement de la stérilité, permettant à des millions de couples dans le monde de procréer par fécondation in vitro (FIV), mais la jeune femme renâcle à l'idée de célébrer trop ostensiblement l'événement.
"Je n'y pense pas vraiment comme à mon 30e anniversaire, a-t-elle expliqué. Je fais juste comme si c'était un anniversaire normal. Je sortirai peut-être avec des amis ou je dînerai avec ma famille. Mais ça restera tranquille."
Louise Joy Brown est née par césarienne le 25 juillet 1978 à l'hôpital d'Oldham, au nord-ouest de l'Angleterre. Elle pesait 2,61 kg.
Depuis neuf ans, ses parents Lesley et John essayaient d'avoir un enfant. Mais toutes leurs tentatives avaient jusque-là échoué, parce que les trompes de Fallope de Lesley étaient obstruées.
Ils entendent alors parler des travaux de deux médecins de l'université de Cambridge, le physiologiste Robert Edwards et le gynécologue Patrick Steptoe, qui depuis près de dix ans tentent de perfectionner la technique de la fécondation in vitro.
Les deux chercheurs réunissent en éprouvette des ovules et spermatozoïdes de Lesley et John Brown, obtenant un embryon qui est réimplanté dans l'utérus maternel pour donner naissance au premier "bébé éprouvette".
AFP
Le 26 juillet 1978, Louise Brown, le premier "bébé éprouvette" naît par césarienne à l'Hôpital général du district de Oldham dans le nord-ouest de l'Angleterre.
Une enfance normale
Louise Brown n'a appris comment elle avait été conçue qu'à l'âge de 4 ans, avant d'entrer à l'école. "Papa et maman m'ont montré la vidéo de ma naissance et ont essayé de m'expliquer", se remémore-t-elle.
"Je pense que c'était juste au cas où les enfants à l'école sauraient, parce que les enfants peuvent parfois être très cruels", ajoute-t-elle. De fait, "les enfants avaient l'habitude de poser des questions comme: 'Comment est-ce que tu as tenu dans cette éprouvette?'", et d'autres du même genre."
Elle affirme avec insistance qu'elle a vécu une enfance des plus normales, "semblable à celle de n'importe quel autre enfant". Louise n'était plus unique. Pas même dans sa propre famille
Sunday, August 24, 2008
Fécondation in vitro (II)
Mise en place de l’ovocyte
L’ovocyte à injecter est placé dans un goutte de milieu (5 µl) recouverte d’huile et maintenu en place avec une pipette de contention («holding pipette»). Le 1er globule polaire est placé à 6h de telle sorte que le fuseau méiotique, sur lequel sont disposés les chromosomes maternels et qui est en général proche du globule polaire, ne se trouve pas sur la trajectoire de la pipette d’injection.
Pénétration de la membrane plasmique (oolemma) et injection du spermatozoïde
L’oolemma n’est pas toujours facile à percer avec la pipette d’injection. Pour faciliter la rupture de l’oolemma, la pipette d’injection contenant le spermatozoïde est enfoncée profondément dans l’ovocyte et un peu du cytoplasme est immédiatement aspiré jusqu’à ce que la membrane de l’ovocyte se rompe. A ce moment le cytoplasme aspiré est doucement réinjecté dans l’ovocyte et le spermatozoïde déposé dans le cytoplasme avec un minimum de milieu. La pipette d’injection est délicatement retirée, et l’ovocyte est libéré de la pipette de contention et immédiatement mis en culture.
Le spermatozoïde est dans la pipette de micro-injection
La pipette de micro-injection perce la membrane de l'ovocyte
La pipette est engagée jusqu'au centre de l'ovocyte
Le spermatozoïde est introduit dans l'ovocyte
La pipette de micro-injection est retirée laissant une petite cicatrice qui disparaîtra rapidement
Observation de la fécondation (Jour 1)
Il est important de déterminer que la fécondation a eu lieu et qu’elle est normale. La fécondation normale se traduit par l’expulsion du 2ème globule polaire dans l’espace périvitellin et la présence de 2 pronuclei dans l’ovocyte. Les pronuclei contiennent le matériel génétique du père et de la mère respectivement. Les pronuclei peuvent apparaître quelques heures après l’insémination conventionnelle ou l’ICSI et sont souvent encore visibles 20h plus tard. Par commodité, les ovocytes sont généralement observés le lendemain du recueil ovocytaire, 14 à 18h après l’insémination. Les ovocytes fécondés sont également appelés zygotes.
Ovocyte fécondé présentant 2 pronuclei et 2 globules polaires
Après une FIV conventionnelle, les cellules qui sont encore associées à l’ovocyte (la corona radiata) doivent être détachées pour que le cytoplasme soit visible. Des mouvements de va-et-vient de l’ovocyte dans une pipette ayant un diamètre légèrement supérieur à l’ovocyte permettent le détachement des cellules de la corona radiata. Cette procédure s'appelle la décoronisation.
Oocyte entouré de la corona radiata
Aspiration de l'ovocyte dans la pipette
Détachement des cellules de la corona radiata
Zygotes surnuméraires
Dans de nombreux cas, le nombre de zygotes obtenus est supérieur au nombre maximum d’embryons qui seront transférés dans l’utérus, à savoir 2 ou 3. Par conséquent, 2 ou 3 zygotes sont maintenus en culture en vue du transfert alors que les autres (zygotes surnuméraires) sont congelés. Ces zygotes congelés pourront être transférés dans l’utérus lors d’un cycle ultérieur.
Echec de fécondation
Bien que nous n’en connaissions pas toutes les raisons, un échec de fécondation peut se produire. En FIV conventionnelle, les spermatozoïdes peuvent présenter une anomalie (mobilité insuffisante, morphologie altérée, présence d’anticorps, anomalie non définie) qui les empêchent de féconder l’ovocyte. L’immaturité des ovocytes peut aussi être une cause d’échec de fécondation.Bien qu’un échec de fécondation soit rare après ICSI, il se rencontre plus fréquemment lorsque seuls quelques ovocytes ont été injectés (de 1 à 3). L’absence d’activation de l’ovocyte, due à une anomalie de l’ovocyte ou du spermatozoïde, semble être la cause la plus probable de l’échec de fécondation après ICSI. Cependant pour un couple donné, un échec de fécondation dans un cycle ICSI ne signifie pas forcément qu’un second échec aura lieu lors d’un traitement ultérieur.
Fécondation anormale
La fécondation est anormale lorsque plus de 2 pronuclei sont présents. Dans la FIV conventionnelle, ce phénomène est très probablement du à l’entrée de plusieurs spermatozoïdes dans l’ovocyte alors que dans l’ICSI, on pense que l’absence d’émission du 2ème globule polaire de l’ovocyte en est la cause. La présence d’un seul pronucleus est également une situation anormale car il s’agit d’une activation du développement se produisant sans le concours du spermatozoïde. Les ovocytes fécondés anormalement ne sont jamais utilisés pour le traitement.
Ovocyte triploïde (avec 3 pronuclei)
Développpement embryonnaire (Jour 2-6)
La disparition des pronuclei indique que les chromosomes paternels (amenés par le spermatozoïde fécondant) et maternels (présents dans l’ovocyte) se sont regroupés pour former le génome embryonnaire et que l’ovocyte fécondé se prépare à la 1ère division cellulaire. Les premières divisions sont visibles le lendemain de l’observation des pronuclei. En général, l’embryon présente 2 à 4 blastomères au jour 2, 4 à 8 blastomères au jour 3 et atteint le stade du blastocyste aux jours 5 ou 6. Le blastocyste est le stade auquel l’embryon s’implante dans l’utérus. Bien que la plupart des zygotes atteignent les premiers stades de division (2-4 blastomères), environ la moitié donnera des blastocystes. Notre pratique est de laisser les embryons en culture jusqu’au jour 3 avant de les transférer dans la cavité utérine.
Embryon à 2 blastomères
Embryon à 4 blastomères
Embryon à 16 blastomères (morula)
Blastocyste
Transfert d’embryons (Jour 3)
Les embryons sont transportés du laboratoire à la salle de transfert qui est équipée d’une petite hotte à flux laminaire chauffante et d’un microscope. Cette installation nous permet de placer les embryons dans le cathéter de transfert juste à côté de la patiente. Le transfert d’embryons a lieu en général au jour 3, lorsque les embryons ont 4 à 8 blastomères. Au maximum 3 embryons sont transférés dans la cavité utérine à l’aide d’ un cathéter. Sous le microscope, les embryons sont aspirés dans le cathéter avec un minimum de milieu de culture. Le médecin introduit ensuite rapidement le cathéter dans la cavité utérine et dépose les embryons dans celle-ci.
Congélation des embryons
D’un point de vue biologique, la congélation des embryons peut se faire à différents stades: lors des premières divisions cellulaires (2-4 blastomères) ou au stade du blastocyste. La congélation peut également se faire au stade du zygote, lorsque les 2 pronuclei sont présents (à ce stade, il ne s’agit pas encore d’un embryon). Malheureusement, avec les techniques dont nous disposons actuellement, il n’est pas possible de congeler des ovocytes sans les endommager.
Dans notre laboratoire, nous congelons les zygotes surnuméraires le jour de l’observation de la fécondation (jour 1). Afin de ne pas endommager le zygote et de préserver son potentiel de développement, il faut le congeler avant la syngamie, c’est-à-dire avant la disparition des pronuclei, et après la synthèse d’ADN, qui a lieu environ 10 à 16h après l’insémination, en prévision de la 1ère division cellulaire. De manière générale, nous congelons les zygotes entre 18 et 20h après l’insémination.
Pour protéger le zygote de la congélation, on ajoute des cryoprotecteurs (1,2-propanediol et sucrose) à la solution de congélation. Après équilibration avec la solution de congélation, les zygotes sont placés dans des paillettes qui sont mises dans un appareil permettant de contrôler très précisément la vitesse de refroidissement et d’induire la cristallisation à un moment déterminé. La congélation se fait très lentement de telle sorte à éviter la formation de gros cristaux de glace à l’intérieur du zygote. Les zygotes sont ensuite conservés à très basse température dans de l’azote liquide (-196 °C).
Transfert d’embryons congelés
La veille du transfert prévu, les zygotes sont décongelés, lavés pour éliminer les cryoprotecteurs et mis en culture jusqu’au lendemain pour qu’ils effectuent leur première division cellulaire. Bien qu’en moyenne, 75% des zygotes survivent à la congélation, il peut arriver que, pour un couple donné, aucun de leurs zygotes ne survive. Dans ce cas, le transfert est annulé.
Pour en savoir plus sur le laboratoire
Généralités
En dehors du corps humain, les gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) et les embryons doivent être maintenus constamment à une température de 37°C, dans un environnement stérile et dans un milieu de culture adéquat. Au laboratoire, des unités chauffantes permettent de garantir une température constante de 37°C. Pour protéger les gamètes et embryons de toute infection, tout le matériel utilisé est stérile et jeté après usage, toutes les manipulations se font dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Les embryons doivent également être à l’abri de tout agent toxique : tout le matériel utilisé qui entre en contact avec le milieu ou les embryons (boîte de Petri, tubes, pipettes, seringue, cathéter) doit être par conséquent soigneusement sélectionné. Une attention particulière est apportée à l’identification des patients :le nom de la patiente est inscrit sur toutes les boîtes, tubes ou paillettes contenant ses gamètes ou embryons.
Culture embryonnaire
La culture des embryons se fait dans des petites gouttes (20m l) de milieu de culture déposées au fond d’une boîte de Petri et recouvertes d’huile pour éviter l’évaporation, limiter les échanges gazeux et protéger des contaminations. Les boîtes sont gardées dans un incubateur dont la température est fixée à 37°C et dont l’air est enrichi en CO2 (5%). Pour éviter de les perturber, l’observation des embryons au microscope est limitée au strict minimum . Lorsque les embryons doivent être déplacés ou changés de milieu, ils sont manipulés à l’aide d’une pipette en verres très fines (la taille d’un embryon représente environ un dixième de millimètres) sous une loupe binoculaire équipée d’un plaque chauffante, dans un environnement stérile.
Milieux de culture
Les milieux de culture jouent un rôle très important dans la FIV car ils apportent les éléments métaboliques nécessaires à la survie des gamètes et permettent aux phénomènes biologiques (tels que la mobilité des spermatozoïdes, la fécondation, les divisions cellulaires, l’activation génomique, la différenciation des cellules embryonnaires et du trophectoderme) de se produire normalement. Le spermatozoïde, les ovocytes et les embryons n’ont pas tous les mêmes besoins métaboliques, de plus les besoins varient en fonction des étapes du développement. C’est pour cela que l’utilisation de milieux de culture, adaptés à des étapes particulières du développement in vitro et que l’on appelle « séquentiels », tend à se généraliser dans les laboratoires FIV. Dans notre laboratoire, nous utilisons un milieu pour la fécondation et un autre pour le développement jusqu’au stade de 8 blastomères.
L’ovocyte à injecter est placé dans un goutte de milieu (5 µl) recouverte d’huile et maintenu en place avec une pipette de contention («holding pipette»). Le 1er globule polaire est placé à 6h de telle sorte que le fuseau méiotique, sur lequel sont disposés les chromosomes maternels et qui est en général proche du globule polaire, ne se trouve pas sur la trajectoire de la pipette d’injection.
Pénétration de la membrane plasmique (oolemma) et injection du spermatozoïde
L’oolemma n’est pas toujours facile à percer avec la pipette d’injection. Pour faciliter la rupture de l’oolemma, la pipette d’injection contenant le spermatozoïde est enfoncée profondément dans l’ovocyte et un peu du cytoplasme est immédiatement aspiré jusqu’à ce que la membrane de l’ovocyte se rompe. A ce moment le cytoplasme aspiré est doucement réinjecté dans l’ovocyte et le spermatozoïde déposé dans le cytoplasme avec un minimum de milieu. La pipette d’injection est délicatement retirée, et l’ovocyte est libéré de la pipette de contention et immédiatement mis en culture.
Le spermatozoïde est dans la pipette de micro-injection
La pipette de micro-injection perce la membrane de l'ovocyte
La pipette est engagée jusqu'au centre de l'ovocyte
Le spermatozoïde est introduit dans l'ovocyte
La pipette de micro-injection est retirée laissant une petite cicatrice qui disparaîtra rapidement
Observation de la fécondation (Jour 1)
Il est important de déterminer que la fécondation a eu lieu et qu’elle est normale. La fécondation normale se traduit par l’expulsion du 2ème globule polaire dans l’espace périvitellin et la présence de 2 pronuclei dans l’ovocyte. Les pronuclei contiennent le matériel génétique du père et de la mère respectivement. Les pronuclei peuvent apparaître quelques heures après l’insémination conventionnelle ou l’ICSI et sont souvent encore visibles 20h plus tard. Par commodité, les ovocytes sont généralement observés le lendemain du recueil ovocytaire, 14 à 18h après l’insémination. Les ovocytes fécondés sont également appelés zygotes.
Ovocyte fécondé présentant 2 pronuclei et 2 globules polaires
Après une FIV conventionnelle, les cellules qui sont encore associées à l’ovocyte (la corona radiata) doivent être détachées pour que le cytoplasme soit visible. Des mouvements de va-et-vient de l’ovocyte dans une pipette ayant un diamètre légèrement supérieur à l’ovocyte permettent le détachement des cellules de la corona radiata. Cette procédure s'appelle la décoronisation.
Oocyte entouré de la corona radiata
Aspiration de l'ovocyte dans la pipette
Détachement des cellules de la corona radiata
Zygotes surnuméraires
Dans de nombreux cas, le nombre de zygotes obtenus est supérieur au nombre maximum d’embryons qui seront transférés dans l’utérus, à savoir 2 ou 3. Par conséquent, 2 ou 3 zygotes sont maintenus en culture en vue du transfert alors que les autres (zygotes surnuméraires) sont congelés. Ces zygotes congelés pourront être transférés dans l’utérus lors d’un cycle ultérieur.
Echec de fécondation
Bien que nous n’en connaissions pas toutes les raisons, un échec de fécondation peut se produire. En FIV conventionnelle, les spermatozoïdes peuvent présenter une anomalie (mobilité insuffisante, morphologie altérée, présence d’anticorps, anomalie non définie) qui les empêchent de féconder l’ovocyte. L’immaturité des ovocytes peut aussi être une cause d’échec de fécondation.Bien qu’un échec de fécondation soit rare après ICSI, il se rencontre plus fréquemment lorsque seuls quelques ovocytes ont été injectés (de 1 à 3). L’absence d’activation de l’ovocyte, due à une anomalie de l’ovocyte ou du spermatozoïde, semble être la cause la plus probable de l’échec de fécondation après ICSI. Cependant pour un couple donné, un échec de fécondation dans un cycle ICSI ne signifie pas forcément qu’un second échec aura lieu lors d’un traitement ultérieur.
Fécondation anormale
La fécondation est anormale lorsque plus de 2 pronuclei sont présents. Dans la FIV conventionnelle, ce phénomène est très probablement du à l’entrée de plusieurs spermatozoïdes dans l’ovocyte alors que dans l’ICSI, on pense que l’absence d’émission du 2ème globule polaire de l’ovocyte en est la cause. La présence d’un seul pronucleus est également une situation anormale car il s’agit d’une activation du développement se produisant sans le concours du spermatozoïde. Les ovocytes fécondés anormalement ne sont jamais utilisés pour le traitement.
Ovocyte triploïde (avec 3 pronuclei)
Développpement embryonnaire (Jour 2-6)
La disparition des pronuclei indique que les chromosomes paternels (amenés par le spermatozoïde fécondant) et maternels (présents dans l’ovocyte) se sont regroupés pour former le génome embryonnaire et que l’ovocyte fécondé se prépare à la 1ère division cellulaire. Les premières divisions sont visibles le lendemain de l’observation des pronuclei. En général, l’embryon présente 2 à 4 blastomères au jour 2, 4 à 8 blastomères au jour 3 et atteint le stade du blastocyste aux jours 5 ou 6. Le blastocyste est le stade auquel l’embryon s’implante dans l’utérus. Bien que la plupart des zygotes atteignent les premiers stades de division (2-4 blastomères), environ la moitié donnera des blastocystes. Notre pratique est de laisser les embryons en culture jusqu’au jour 3 avant de les transférer dans la cavité utérine.
Embryon à 2 blastomères
Embryon à 4 blastomères
Embryon à 16 blastomères (morula)
Blastocyste
Transfert d’embryons (Jour 3)
Les embryons sont transportés du laboratoire à la salle de transfert qui est équipée d’une petite hotte à flux laminaire chauffante et d’un microscope. Cette installation nous permet de placer les embryons dans le cathéter de transfert juste à côté de la patiente. Le transfert d’embryons a lieu en général au jour 3, lorsque les embryons ont 4 à 8 blastomères. Au maximum 3 embryons sont transférés dans la cavité utérine à l’aide d’ un cathéter. Sous le microscope, les embryons sont aspirés dans le cathéter avec un minimum de milieu de culture. Le médecin introduit ensuite rapidement le cathéter dans la cavité utérine et dépose les embryons dans celle-ci.
Congélation des embryons
D’un point de vue biologique, la congélation des embryons peut se faire à différents stades: lors des premières divisions cellulaires (2-4 blastomères) ou au stade du blastocyste. La congélation peut également se faire au stade du zygote, lorsque les 2 pronuclei sont présents (à ce stade, il ne s’agit pas encore d’un embryon). Malheureusement, avec les techniques dont nous disposons actuellement, il n’est pas possible de congeler des ovocytes sans les endommager.
Dans notre laboratoire, nous congelons les zygotes surnuméraires le jour de l’observation de la fécondation (jour 1). Afin de ne pas endommager le zygote et de préserver son potentiel de développement, il faut le congeler avant la syngamie, c’est-à-dire avant la disparition des pronuclei, et après la synthèse d’ADN, qui a lieu environ 10 à 16h après l’insémination, en prévision de la 1ère division cellulaire. De manière générale, nous congelons les zygotes entre 18 et 20h après l’insémination.
Pour protéger le zygote de la congélation, on ajoute des cryoprotecteurs (1,2-propanediol et sucrose) à la solution de congélation. Après équilibration avec la solution de congélation, les zygotes sont placés dans des paillettes qui sont mises dans un appareil permettant de contrôler très précisément la vitesse de refroidissement et d’induire la cristallisation à un moment déterminé. La congélation se fait très lentement de telle sorte à éviter la formation de gros cristaux de glace à l’intérieur du zygote. Les zygotes sont ensuite conservés à très basse température dans de l’azote liquide (-196 °C).
Transfert d’embryons congelés
La veille du transfert prévu, les zygotes sont décongelés, lavés pour éliminer les cryoprotecteurs et mis en culture jusqu’au lendemain pour qu’ils effectuent leur première division cellulaire. Bien qu’en moyenne, 75% des zygotes survivent à la congélation, il peut arriver que, pour un couple donné, aucun de leurs zygotes ne survive. Dans ce cas, le transfert est annulé.
Pour en savoir plus sur le laboratoire
Généralités
En dehors du corps humain, les gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) et les embryons doivent être maintenus constamment à une température de 37°C, dans un environnement stérile et dans un milieu de culture adéquat. Au laboratoire, des unités chauffantes permettent de garantir une température constante de 37°C. Pour protéger les gamètes et embryons de toute infection, tout le matériel utilisé est stérile et jeté après usage, toutes les manipulations se font dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Les embryons doivent également être à l’abri de tout agent toxique : tout le matériel utilisé qui entre en contact avec le milieu ou les embryons (boîte de Petri, tubes, pipettes, seringue, cathéter) doit être par conséquent soigneusement sélectionné. Une attention particulière est apportée à l’identification des patients :le nom de la patiente est inscrit sur toutes les boîtes, tubes ou paillettes contenant ses gamètes ou embryons.
Culture embryonnaire
La culture des embryons se fait dans des petites gouttes (20m l) de milieu de culture déposées au fond d’une boîte de Petri et recouvertes d’huile pour éviter l’évaporation, limiter les échanges gazeux et protéger des contaminations. Les boîtes sont gardées dans un incubateur dont la température est fixée à 37°C et dont l’air est enrichi en CO2 (5%). Pour éviter de les perturber, l’observation des embryons au microscope est limitée au strict minimum . Lorsque les embryons doivent être déplacés ou changés de milieu, ils sont manipulés à l’aide d’une pipette en verres très fines (la taille d’un embryon représente environ un dixième de millimètres) sous une loupe binoculaire équipée d’un plaque chauffante, dans un environnement stérile.
Milieux de culture
Les milieux de culture jouent un rôle très important dans la FIV car ils apportent les éléments métaboliques nécessaires à la survie des gamètes et permettent aux phénomènes biologiques (tels que la mobilité des spermatozoïdes, la fécondation, les divisions cellulaires, l’activation génomique, la différenciation des cellules embryonnaires et du trophectoderme) de se produire normalement. Le spermatozoïde, les ovocytes et les embryons n’ont pas tous les mêmes besoins métaboliques, de plus les besoins varient en fonction des étapes du développement. C’est pour cela que l’utilisation de milieux de culture, adaptés à des étapes particulières du développement in vitro et que l’on appelle « séquentiels », tend à se généraliser dans les laboratoires FIV. Dans notre laboratoire, nous utilisons un milieu pour la fécondation et un autre pour le développement jusqu’au stade de 8 blastomères.
Fécondation in vitro (II)
Mise en place de l’ovocyte
L’ovocyte à injecter est placé dans un goutte de milieu (5 µl) recouverte d’huile et maintenu en place avec une pipette de contention («holding pipette»). Le 1er globule polaire est placé à 6h de telle sorte que le fuseau méiotique, sur lequel sont disposés les chromosomes maternels et qui est en général proche du globule polaire, ne se trouve pas sur la trajectoire de la pipette d’injection.
Pénétration de la membrane plasmique (oolemma) et injection du spermatozoïde
L’oolemma n’est pas toujours facile à percer avec la pipette d’injection. Pour faciliter la rupture de l’oolemma, la pipette d’injection contenant le spermatozoïde est enfoncée profondément dans l’ovocyte et un peu du cytoplasme est immédiatement aspiré jusqu’à ce que la membrane de l’ovocyte se rompe. A ce moment le cytoplasme aspiré est doucement réinjecté dans l’ovocyte et le spermatozoïde déposé dans le cytoplasme avec un minimum de milieu. La pipette d’injection est délicatement retirée, et l’ovocyte est libéré de la pipette de contention et immédiatement mis en culture.
Le spermatozoïde est dans la pipette de micro-injection
La pipette de micro-injection perce la membrane de l'ovocyte
La pipette est engagée jusqu'au centre de l'ovocyte
Le spermatozoïde est introduit dans l'ovocyte
La pipette de micro-injection est retirée laissant une petite cicatrice qui disparaîtra rapidement
Observation de la fécondation (Jour 1)
Il est important de déterminer que la fécondation a eu lieu et qu’elle est normale. La fécondation normale se traduit par l’expulsion du 2ème globule polaire dans l’espace périvitellin et la présence de 2 pronuclei dans l’ovocyte. Les pronuclei contiennent le matériel génétique du père et de la mère respectivement. Les pronuclei peuvent apparaître quelques heures après l’insémination conventionnelle ou l’ICSI et sont souvent encore visibles 20h plus tard. Par commodité, les ovocytes sont généralement observés le lendemain du recueil ovocytaire, 14 à 18h après l’insémination. Les ovocytes fécondés sont également appelés zygotes.
Ovocyte fécondé présentant 2 pronuclei et 2 globules polaires
Après une FIV conventionnelle, les cellules qui sont encore associées à l’ovocyte (la corona radiata) doivent être détachées pour que le cytoplasme soit visible. Des mouvements de va-et-vient de l’ovocyte dans une pipette ayant un diamètre légèrement supérieur à l’ovocyte permettent le détachement des cellules de la corona radiata. Cette procédure s'appelle la décoronisation.
Oocyte entouré de la corona radiata
Aspiration de l'ovocyte dans la pipette
Détachement des cellules de la corona radiata
Zygotes surnuméraires
Dans de nombreux cas, le nombre de zygotes obtenus est supérieur au nombre maximum d’embryons qui seront transférés dans l’utérus, à savoir 2 ou 3. Par conséquent, 2 ou 3 zygotes sont maintenus en culture en vue du transfert alors que les autres (zygotes surnuméraires) sont congelés. Ces zygotes congelés pourront être transférés dans l’utérus lors d’un cycle ultérieur.
Echec de fécondation
Bien que nous n’en connaissions pas toutes les raisons, un échec de fécondation peut se produire. En FIV conventionnelle, les spermatozoïdes peuvent présenter une anomalie (mobilité insuffisante, morphologie altérée, présence d’anticorps, anomalie non définie) qui les empêchent de féconder l’ovocyte. L’immaturité des ovocytes peut aussi être une cause d’échec de fécondation.Bien qu’un échec de fécondation soit rare après ICSI, il se rencontre plus fréquemment lorsque seuls quelques ovocytes ont été injectés (de 1 à 3). L’absence d’activation de l’ovocyte, due à une anomalie de l’ovocyte ou du spermatozoïde, semble être la cause la plus probable de l’échec de fécondation après ICSI. Cependant pour un couple donné, un échec de fécondation dans un cycle ICSI ne signifie pas forcément qu’un second échec aura lieu lors d’un traitement ultérieur.
Fécondation anormale
La fécondation est anormale lorsque plus de 2 pronuclei sont présents. Dans la FIV conventionnelle, ce phénomène est très probablement du à l’entrée de plusieurs spermatozoïdes dans l’ovocyte alors que dans l’ICSI, on pense que l’absence d’émission du 2ème globule polaire de l’ovocyte en est la cause. La présence d’un seul pronucleus est également une situation anormale car il s’agit d’une activation du développement se produisant sans le concours du spermatozoïde. Les ovocytes fécondés anormalement ne sont jamais utilisés pour le traitement.
Ovocyte triploïde (avec 3 pronuclei)
Développpement embryonnaire (Jour 2-6)
La disparition des pronuclei indique que les chromosomes paternels (amenés par le spermatozoïde fécondant) et maternels (présents dans l’ovocyte) se sont regroupés pour former le génome embryonnaire et que l’ovocyte fécondé se prépare à la 1ère division cellulaire. Les premières divisions sont visibles le lendemain de l’observation des pronuclei. En général, l’embryon présente 2 à 4 blastomères au jour 2, 4 à 8 blastomères au jour 3 et atteint le stade du blastocyste aux jours 5 ou 6. Le blastocyste est le stade auquel l’embryon s’implante dans l’utérus. Bien que la plupart des zygotes atteignent les premiers stades de division (2-4 blastomères), environ la moitié donnera des blastocystes. Notre pratique est de laisser les embryons en culture jusqu’au jour 3 avant de les transférer dans la cavité utérine.
Embryon à 2 blastomères
Embryon à 4 blastomères
Embryon à 16 blastomères (morula)
Blastocyste
Transfert d’embryons (Jour 3)
Les embryons sont transportés du laboratoire à la salle de transfert qui est équipée d’une petite hotte à flux laminaire chauffante et d’un microscope. Cette installation nous permet de placer les embryons dans le cathéter de transfert juste à côté de la patiente. Le transfert d’embryons a lieu en général au jour 3, lorsque les embryons ont 4 à 8 blastomères. Au maximum 3 embryons sont transférés dans la cavité utérine à l’aide d’ un cathéter. Sous le microscope, les embryons sont aspirés dans le cathéter avec un minimum de milieu de culture. Le médecin introduit ensuite rapidement le cathéter dans la cavité utérine et dépose les embryons dans celle-ci.
Congélation des embryons
D’un point de vue biologique, la congélation des embryons peut se faire à différents stades: lors des premières divisions cellulaires (2-4 blastomères) ou au stade du blastocyste. La congélation peut également se faire au stade du zygote, lorsque les 2 pronuclei sont présents (à ce stade, il ne s’agit pas encore d’un embryon). Malheureusement, avec les techniques dont nous disposons actuellement, il n’est pas possible de congeler des ovocytes sans les endommager.
Dans notre laboratoire, nous congelons les zygotes surnuméraires le jour de l’observation de la fécondation (jour 1). Afin de ne pas endommager le zygote et de préserver son potentiel de développement, il faut le congeler avant la syngamie, c’est-à-dire avant la disparition des pronuclei, et après la synthèse d’ADN, qui a lieu environ 10 à 16h après l’insémination, en prévision de la 1ère division cellulaire. De manière générale, nous congelons les zygotes entre 18 et 20h après l’insémination.
Pour protéger le zygote de la congélation, on ajoute des cryoprotecteurs (1,2-propanediol et sucrose) à la solution de congélation. Après équilibration avec la solution de congélation, les zygotes sont placés dans des paillettes qui sont mises dans un appareil permettant de contrôler très précisément la vitesse de refroidissement et d’induire la cristallisation à un moment déterminé. La congélation se fait très lentement de telle sorte à éviter la formation de gros cristaux de glace à l’intérieur du zygote. Les zygotes sont ensuite conservés à très basse température dans de l’azote liquide (-196 °C).
Transfert d’embryons congelés
La veille du transfert prévu, les zygotes sont décongelés, lavés pour éliminer les cryoprotecteurs et mis en culture jusqu’au lendemain pour qu’ils effectuent leur première division cellulaire. Bien qu’en moyenne, 75% des zygotes survivent à la congélation, il peut arriver que, pour un couple donné, aucun de leurs zygotes ne survive. Dans ce cas, le transfert est annulé.
Pour en savoir plus sur le laboratoire
Généralités
En dehors du corps humain, les gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) et les embryons doivent être maintenus constamment à une température de 37°C, dans un environnement stérile et dans un milieu de culture adéquat. Au laboratoire, des unités chauffantes permettent de garantir une température constante de 37°C. Pour protéger les gamètes et embryons de toute infection, tout le matériel utilisé est stérile et jeté après usage, toutes les manipulations se font dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Les embryons doivent également être à l’abri de tout agent toxique : tout le matériel utilisé qui entre en contact avec le milieu ou les embryons (boîte de Petri, tubes, pipettes, seringue, cathéter) doit être par conséquent soigneusement sélectionné. Une attention particulière est apportée à l’identification des patients :le nom de la patiente est inscrit sur toutes les boîtes, tubes ou paillettes contenant ses gamètes ou embryons.
Culture embryonnaire
La culture des embryons se fait dans des petites gouttes (20m l) de milieu de culture déposées au fond d’une boîte de Petri et recouvertes d’huile pour éviter l’évaporation, limiter les échanges gazeux et protéger des contaminations. Les boîtes sont gardées dans un incubateur dont la température est fixée à 37°C et dont l’air est enrichi en CO2 (5%). Pour éviter de les perturber, l’observation des embryons au microscope est limitée au strict minimum . Lorsque les embryons doivent être déplacés ou changés de milieu, ils sont manipulés à l’aide d’une pipette en verres très fines (la taille d’un embryon représente environ un dixième de millimètres) sous une loupe binoculaire équipée d’un plaque chauffante, dans un environnement stérile.
Milieux de culture
Les milieux de culture jouent un rôle très important dans la FIV car ils apportent les éléments métaboliques nécessaires à la survie des gamètes et permettent aux phénomènes biologiques (tels que la mobilité des spermatozoïdes, la fécondation, les divisions cellulaires, l’activation génomique, la différenciation des cellules embryonnaires et du trophectoderme) de se produire normalement. Le spermatozoïde, les ovocytes et les embryons n’ont pas tous les mêmes besoins métaboliques, de plus les besoins varient en fonction des étapes du développement. C’est pour cela que l’utilisation de milieux de culture, adaptés à des étapes particulières du développement in vitro et que l’on appelle « séquentiels », tend à se généraliser dans les laboratoires FIV. Dans notre laboratoire, nous utilisons un milieu pour la fécondation et un autre pour le développement jusqu’au stade de 8 blastomères.
L’ovocyte à injecter est placé dans un goutte de milieu (5 µl) recouverte d’huile et maintenu en place avec une pipette de contention («holding pipette»). Le 1er globule polaire est placé à 6h de telle sorte que le fuseau méiotique, sur lequel sont disposés les chromosomes maternels et qui est en général proche du globule polaire, ne se trouve pas sur la trajectoire de la pipette d’injection.
Pénétration de la membrane plasmique (oolemma) et injection du spermatozoïde
L’oolemma n’est pas toujours facile à percer avec la pipette d’injection. Pour faciliter la rupture de l’oolemma, la pipette d’injection contenant le spermatozoïde est enfoncée profondément dans l’ovocyte et un peu du cytoplasme est immédiatement aspiré jusqu’à ce que la membrane de l’ovocyte se rompe. A ce moment le cytoplasme aspiré est doucement réinjecté dans l’ovocyte et le spermatozoïde déposé dans le cytoplasme avec un minimum de milieu. La pipette d’injection est délicatement retirée, et l’ovocyte est libéré de la pipette de contention et immédiatement mis en culture.
Le spermatozoïde est dans la pipette de micro-injection
La pipette de micro-injection perce la membrane de l'ovocyte
La pipette est engagée jusqu'au centre de l'ovocyte
Le spermatozoïde est introduit dans l'ovocyte
La pipette de micro-injection est retirée laissant une petite cicatrice qui disparaîtra rapidement
Observation de la fécondation (Jour 1)
Il est important de déterminer que la fécondation a eu lieu et qu’elle est normale. La fécondation normale se traduit par l’expulsion du 2ème globule polaire dans l’espace périvitellin et la présence de 2 pronuclei dans l’ovocyte. Les pronuclei contiennent le matériel génétique du père et de la mère respectivement. Les pronuclei peuvent apparaître quelques heures après l’insémination conventionnelle ou l’ICSI et sont souvent encore visibles 20h plus tard. Par commodité, les ovocytes sont généralement observés le lendemain du recueil ovocytaire, 14 à 18h après l’insémination. Les ovocytes fécondés sont également appelés zygotes.
Ovocyte fécondé présentant 2 pronuclei et 2 globules polaires
Après une FIV conventionnelle, les cellules qui sont encore associées à l’ovocyte (la corona radiata) doivent être détachées pour que le cytoplasme soit visible. Des mouvements de va-et-vient de l’ovocyte dans une pipette ayant un diamètre légèrement supérieur à l’ovocyte permettent le détachement des cellules de la corona radiata. Cette procédure s'appelle la décoronisation.
Oocyte entouré de la corona radiata
Aspiration de l'ovocyte dans la pipette
Détachement des cellules de la corona radiata
Zygotes surnuméraires
Dans de nombreux cas, le nombre de zygotes obtenus est supérieur au nombre maximum d’embryons qui seront transférés dans l’utérus, à savoir 2 ou 3. Par conséquent, 2 ou 3 zygotes sont maintenus en culture en vue du transfert alors que les autres (zygotes surnuméraires) sont congelés. Ces zygotes congelés pourront être transférés dans l’utérus lors d’un cycle ultérieur.
Echec de fécondation
Bien que nous n’en connaissions pas toutes les raisons, un échec de fécondation peut se produire. En FIV conventionnelle, les spermatozoïdes peuvent présenter une anomalie (mobilité insuffisante, morphologie altérée, présence d’anticorps, anomalie non définie) qui les empêchent de féconder l’ovocyte. L’immaturité des ovocytes peut aussi être une cause d’échec de fécondation.Bien qu’un échec de fécondation soit rare après ICSI, il se rencontre plus fréquemment lorsque seuls quelques ovocytes ont été injectés (de 1 à 3). L’absence d’activation de l’ovocyte, due à une anomalie de l’ovocyte ou du spermatozoïde, semble être la cause la plus probable de l’échec de fécondation après ICSI. Cependant pour un couple donné, un échec de fécondation dans un cycle ICSI ne signifie pas forcément qu’un second échec aura lieu lors d’un traitement ultérieur.
Fécondation anormale
La fécondation est anormale lorsque plus de 2 pronuclei sont présents. Dans la FIV conventionnelle, ce phénomène est très probablement du à l’entrée de plusieurs spermatozoïdes dans l’ovocyte alors que dans l’ICSI, on pense que l’absence d’émission du 2ème globule polaire de l’ovocyte en est la cause. La présence d’un seul pronucleus est également une situation anormale car il s’agit d’une activation du développement se produisant sans le concours du spermatozoïde. Les ovocytes fécondés anormalement ne sont jamais utilisés pour le traitement.
Ovocyte triploïde (avec 3 pronuclei)
Développpement embryonnaire (Jour 2-6)
La disparition des pronuclei indique que les chromosomes paternels (amenés par le spermatozoïde fécondant) et maternels (présents dans l’ovocyte) se sont regroupés pour former le génome embryonnaire et que l’ovocyte fécondé se prépare à la 1ère division cellulaire. Les premières divisions sont visibles le lendemain de l’observation des pronuclei. En général, l’embryon présente 2 à 4 blastomères au jour 2, 4 à 8 blastomères au jour 3 et atteint le stade du blastocyste aux jours 5 ou 6. Le blastocyste est le stade auquel l’embryon s’implante dans l’utérus. Bien que la plupart des zygotes atteignent les premiers stades de division (2-4 blastomères), environ la moitié donnera des blastocystes. Notre pratique est de laisser les embryons en culture jusqu’au jour 3 avant de les transférer dans la cavité utérine.
Embryon à 2 blastomères
Embryon à 4 blastomères
Embryon à 16 blastomères (morula)
Blastocyste
Transfert d’embryons (Jour 3)
Les embryons sont transportés du laboratoire à la salle de transfert qui est équipée d’une petite hotte à flux laminaire chauffante et d’un microscope. Cette installation nous permet de placer les embryons dans le cathéter de transfert juste à côté de la patiente. Le transfert d’embryons a lieu en général au jour 3, lorsque les embryons ont 4 à 8 blastomères. Au maximum 3 embryons sont transférés dans la cavité utérine à l’aide d’ un cathéter. Sous le microscope, les embryons sont aspirés dans le cathéter avec un minimum de milieu de culture. Le médecin introduit ensuite rapidement le cathéter dans la cavité utérine et dépose les embryons dans celle-ci.
Congélation des embryons
D’un point de vue biologique, la congélation des embryons peut se faire à différents stades: lors des premières divisions cellulaires (2-4 blastomères) ou au stade du blastocyste. La congélation peut également se faire au stade du zygote, lorsque les 2 pronuclei sont présents (à ce stade, il ne s’agit pas encore d’un embryon). Malheureusement, avec les techniques dont nous disposons actuellement, il n’est pas possible de congeler des ovocytes sans les endommager.
Dans notre laboratoire, nous congelons les zygotes surnuméraires le jour de l’observation de la fécondation (jour 1). Afin de ne pas endommager le zygote et de préserver son potentiel de développement, il faut le congeler avant la syngamie, c’est-à-dire avant la disparition des pronuclei, et après la synthèse d’ADN, qui a lieu environ 10 à 16h après l’insémination, en prévision de la 1ère division cellulaire. De manière générale, nous congelons les zygotes entre 18 et 20h après l’insémination.
Pour protéger le zygote de la congélation, on ajoute des cryoprotecteurs (1,2-propanediol et sucrose) à la solution de congélation. Après équilibration avec la solution de congélation, les zygotes sont placés dans des paillettes qui sont mises dans un appareil permettant de contrôler très précisément la vitesse de refroidissement et d’induire la cristallisation à un moment déterminé. La congélation se fait très lentement de telle sorte à éviter la formation de gros cristaux de glace à l’intérieur du zygote. Les zygotes sont ensuite conservés à très basse température dans de l’azote liquide (-196 °C).
Transfert d’embryons congelés
La veille du transfert prévu, les zygotes sont décongelés, lavés pour éliminer les cryoprotecteurs et mis en culture jusqu’au lendemain pour qu’ils effectuent leur première division cellulaire. Bien qu’en moyenne, 75% des zygotes survivent à la congélation, il peut arriver que, pour un couple donné, aucun de leurs zygotes ne survive. Dans ce cas, le transfert est annulé.
Pour en savoir plus sur le laboratoire
Généralités
En dehors du corps humain, les gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) et les embryons doivent être maintenus constamment à une température de 37°C, dans un environnement stérile et dans un milieu de culture adéquat. Au laboratoire, des unités chauffantes permettent de garantir une température constante de 37°C. Pour protéger les gamètes et embryons de toute infection, tout le matériel utilisé est stérile et jeté après usage, toutes les manipulations se font dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Les embryons doivent également être à l’abri de tout agent toxique : tout le matériel utilisé qui entre en contact avec le milieu ou les embryons (boîte de Petri, tubes, pipettes, seringue, cathéter) doit être par conséquent soigneusement sélectionné. Une attention particulière est apportée à l’identification des patients :le nom de la patiente est inscrit sur toutes les boîtes, tubes ou paillettes contenant ses gamètes ou embryons.
Culture embryonnaire
La culture des embryons se fait dans des petites gouttes (20m l) de milieu de culture déposées au fond d’une boîte de Petri et recouvertes d’huile pour éviter l’évaporation, limiter les échanges gazeux et protéger des contaminations. Les boîtes sont gardées dans un incubateur dont la température est fixée à 37°C et dont l’air est enrichi en CO2 (5%). Pour éviter de les perturber, l’observation des embryons au microscope est limitée au strict minimum . Lorsque les embryons doivent être déplacés ou changés de milieu, ils sont manipulés à l’aide d’une pipette en verres très fines (la taille d’un embryon représente environ un dixième de millimètres) sous une loupe binoculaire équipée d’un plaque chauffante, dans un environnement stérile.
Milieux de culture
Les milieux de culture jouent un rôle très important dans la FIV car ils apportent les éléments métaboliques nécessaires à la survie des gamètes et permettent aux phénomènes biologiques (tels que la mobilité des spermatozoïdes, la fécondation, les divisions cellulaires, l’activation génomique, la différenciation des cellules embryonnaires et du trophectoderme) de se produire normalement. Le spermatozoïde, les ovocytes et les embryons n’ont pas tous les mêmes besoins métaboliques, de plus les besoins varient en fonction des étapes du développement. C’est pour cela que l’utilisation de milieux de culture, adaptés à des étapes particulières du développement in vitro et que l’on appelle « séquentiels », tend à se généraliser dans les laboratoires FIV. Dans notre laboratoire, nous utilisons un milieu pour la fécondation et un autre pour le développement jusqu’au stade de 8 blastomères.
Saturday, August 23, 2008
Fécondation in vitro et ICSI (I)
H. Lucas, F. Urner, N. Jaquenoud, I. Wagner
Les étapes de la fécondation in vitro conventionnelle et de l’ICSI sont identiques sauf en ce qui concerne la rencontre du spermatozoïde et de l’ovocyte. Dans la FIV, le spermatozoïde parvient lui-même à entrer dans l’ovocyte après avoir traversé les barrières qui l’entourent (le cumulus et la zone pellucide) tandis qu’en ICSI le spermatozoïde est placé directement à l’intérieur du cytoplasme de l’ovocyte.
Les étapes principales de la fécondation in vitro, avec ou sans ICSI, sont résumées dans le schéma ci-dessous :
JOUR 0
Recueil des ovocytes
Préparation du sperme
Mise en contact des gamètes : FIV conventionnelle ou ICSI
JOUR 1
Observation de la fécondation, présence de 2 pronuclei, stade: zygote
Développement in vitro de 3 zygotes au maximum
Congélation des zygotes surnuméraires
JOUR 2
Poursuite du développement embryonnaire, stade: embryon 2-4 blastomères
JOUR 3
Transfert d’embryons, stade: embryon 4-8 blastomères
Chaque ovocyte se trouve au sein d’un follicule ovarien qui se présente sous la forme d’un antre rempli de liquide (le liquide folliculaire). La croissance des follicules a été suivie par échographie durant la stimulation ovarienne et ce n’est qu’à partir d’une certaine taille que le médecin a décidé de « déclencher » l’ovulation avec une injection d’hCG. Entre cette injection et l’ovulation, 36h sont nécessaires à la maturation finale de l’ovocyte. Juste avant que l’ovulation ne se produise, le médecin aspire le contenu des follicules, qui est ensuite rapidement examiné sous le microscope, afin de trouver l'ovocyte et de le transférer dans un milieu de culture adéquat. Lorsque l’ovocyte est recueilli, il se trouve englobé dans des couches de cellules folliculaires qui forment le cumulus. Le diamètre de l’ovocyte est d’environ 0,1 mm alors que celui du complexe cumulus-oophorus est d’environ 1 mm.
Oocyte englobé dans son cumulus
Préparation du sperme
Origine des spermatozoïdes
Dans la plupart des cas, ils proviennent de sperme éjaculé mais ils peuvent également provenir de l’épididyme (ponction épididymaire ou MESA) ou directement du testicule (biopsie testiculaire ou TESA). Par ailleurs, les spermatozoïdes humains peuvent être congelés avant utilisation, mais il faut savoir que la congélation entraîne une perte de la mobilité d’environ 50 %. En présence de spermatozoïdes de l’épididyme ou du testicule l’ICSI sera systématiquement choisie. En ce qui concerne le sperme éjaculé, c’est principalement la qualité du spermogramme qui déterminera le type de traitement à proposer au couple.
Spermatozoïdes nageant dans un milieu de culture
Spermatozoïdes éjaculés
L’éjaculat est produit juste après le recueil des ovocytes. Le but de la préparation du sperme éjaculé est d’éliminer le plasma séminal et de sélectionner une population de spermatozoïdes mobiles et morphologiquement normaux. L’une des méthodes couramment utilisée est la centrifugation des spermatozoïdes auà travers d’un gradient de densité (PureSperm) : les spermatozoïdes de faible densité (morts, anormaux) ainsi que les contaminants cellulaires de l’éjaculat s’accumulent dans les fractions de densité correspondante, alors que les spermatozoïdes de plus forte densité (mobiles, normaux) traversent le gradient et se retrouvent dans le fondculot du tube. Les spermatozoïdes ainsi isolés sont lavés avec du milieu de culture afin d’éliminer toute trace de PureSperm.
Spermatozoïdes épididymaires
Les spermatozoïdes de l’épididyme peuvent être aspirés et congelés avant le cycle de traitement de la femme. Il est aussi possible que l’aspiration épididymaire se fasse le même jour que le recueil des ovocytes.
Spermatozoïdes testiculaires
La biopsie testiculaire est déchirée en petits morceaux pour permettre la libération de spermatozoïdes dans le milieu. Seuls les spermatozoïdes matures sont utilisés pour l’ICSI. A l’heure actuelle en Suisse, nous n’utilisons pas les spermatides qui sont des cellules germinales haploïdes encore immatures. La biopsie peut être prélevée avant le cycle de traitement de la femme et les spermatozoïdes congelés.
Mise en fécondation des ovocytes
La FIV - fécondation in vitro traditionnelle
Les ovocytes sont mis en présence de nombreux spermatozoïdes mobiles dont un seul va habituellement féconder l’ovocyte. Les ovocytes prélevés par ponction folliculaire sont placés individuellement ou par groupe de 2 ou 3 dans 0,5 ml de milieu de culture. Les spermatozoïdes préparés sont ajoutés aux ovocytes (50’000-100’000 spermatozoïdes mobiles/ml). Pendant les heures qui suivent, certains spermatozoïdes vont traverser le cumulus et s’attacher à la zone pellucide qui entoure l’ovocyte. La zone pellucide est une barrière importante et le spermatozoïde doit exercer des mouvements vigoureux pour la traverser. En général, un seul de ces spermatozoïdes parvient à traverser la zone pellucide, atteindre la surface de l’ovocyte et pénétrer dans l’ovocyte. Bien que la mobilité du spermatozoïde soit essentielle pour qu’il parvienne jusqu’à l’ovocyte, la morphologie du spermatozoïde semble également importante pour assurer le succès de la fécondation in vitro.
Ovocytes en contact avec des spermatozoïdes
L’ICSI - « intracytoplasmic sperm injection »
Avec cette technique, un spermatozoïde est directement injecté dans l’ovocyte à l’aide de pipettes en verre très fines. Un microscope équipé d’une excellente optique et une paire de micromanipulateurs sont nécessaires pour l’ICSI.
Technicien procédant à une ICSI
Préparation des ovocytes
Il est nécessaire que l’ovocyte soit bien visible pour permettre l’injection d’un spermatozoïde. Pour cela, les cellules du cumulus qui entourent l’ovocyte sont éliminées en utilisant une enzyme appelée hyaluronidase.
Détermination de la maturité de l’ovocyte
Seul un ovocyte mature peut être fécondé. L’ovocyte mature se trouve en métaphase de la seconde division méiotique (métaphase II) et se caractérise par la présence du 1er globule polaire dans l’espace périvitellin (entre la surface de l’ovocyte et la zone pellucide). L’ovocyte totalement immature se trouve au stade diplotène de la prophase I et présente un grand noyau appelé vésicule germinale. L’ovocyte en cours de maturation se trouve à un stade intermédiaire de la méiose; il n’a plus de vésicule germinale mais le 1er globule polaire n’est pas encore apparu. La maturation de l’ovocyte se fait dans l’ovaire en réponse à l’hCG injecté pour le «déclenchement» de l’ovulation. Elle est en général achevée lors du recueil des ovocytes mais il arrive que quelques uns des ovocytes soient encore immatures. Les ovocytes immatures représentent en général une faible proportion des ovocytes récoltés. Ces ovocytes sont laissés en culture et ne sont injectés que s’ils parviennent à maturité in vitro.
Ovocyte et son globule polaire
Sélection du spermatozoïde
Les spermatozoïdes mobiles et si possible de morphologie normale sont choisis pour être injectés. La mobilité est importante car elle signale que le spermatozoïde est vivant. Pour ralentir la vitesse de déplacement des spermatozoïdes, on ajoute du polyvinyilpyrrolidone (PVP, 10%) à la suspension juste avant usage. Une goutte (5 µl) de cette suspension est déposée sur un support et recouverte d’huile. Sous le microscope, le spermatozoïde sélectionné est immobilisé en comprimant sa queue contre le support avec la pipette d’injection et aspiré dans celle-ci, la queue en premier. L’immobilisation du spermatozoïde est nécessaire pour éviter que des lésions soient induites par les mouvements du spermatozoïde dans le cytoplasme et pour permettre l’activation de l’ovocyte.
Les étapes de la fécondation in vitro conventionnelle et de l’ICSI sont identiques sauf en ce qui concerne la rencontre du spermatozoïde et de l’ovocyte. Dans la FIV, le spermatozoïde parvient lui-même à entrer dans l’ovocyte après avoir traversé les barrières qui l’entourent (le cumulus et la zone pellucide) tandis qu’en ICSI le spermatozoïde est placé directement à l’intérieur du cytoplasme de l’ovocyte.
Les étapes principales de la fécondation in vitro, avec ou sans ICSI, sont résumées dans le schéma ci-dessous :
JOUR 0
Recueil des ovocytes
Préparation du sperme
Mise en contact des gamètes : FIV conventionnelle ou ICSI
JOUR 1
Observation de la fécondation, présence de 2 pronuclei, stade: zygote
Développement in vitro de 3 zygotes au maximum
Congélation des zygotes surnuméraires
JOUR 2
Poursuite du développement embryonnaire, stade: embryon 2-4 blastomères
JOUR 3
Transfert d’embryons, stade: embryon 4-8 blastomères
Chaque ovocyte se trouve au sein d’un follicule ovarien qui se présente sous la forme d’un antre rempli de liquide (le liquide folliculaire). La croissance des follicules a été suivie par échographie durant la stimulation ovarienne et ce n’est qu’à partir d’une certaine taille que le médecin a décidé de « déclencher » l’ovulation avec une injection d’hCG. Entre cette injection et l’ovulation, 36h sont nécessaires à la maturation finale de l’ovocyte. Juste avant que l’ovulation ne se produise, le médecin aspire le contenu des follicules, qui est ensuite rapidement examiné sous le microscope, afin de trouver l'ovocyte et de le transférer dans un milieu de culture adéquat. Lorsque l’ovocyte est recueilli, il se trouve englobé dans des couches de cellules folliculaires qui forment le cumulus. Le diamètre de l’ovocyte est d’environ 0,1 mm alors que celui du complexe cumulus-oophorus est d’environ 1 mm.
Oocyte englobé dans son cumulus
Préparation du sperme
Origine des spermatozoïdes
Dans la plupart des cas, ils proviennent de sperme éjaculé mais ils peuvent également provenir de l’épididyme (ponction épididymaire ou MESA) ou directement du testicule (biopsie testiculaire ou TESA). Par ailleurs, les spermatozoïdes humains peuvent être congelés avant utilisation, mais il faut savoir que la congélation entraîne une perte de la mobilité d’environ 50 %. En présence de spermatozoïdes de l’épididyme ou du testicule l’ICSI sera systématiquement choisie. En ce qui concerne le sperme éjaculé, c’est principalement la qualité du spermogramme qui déterminera le type de traitement à proposer au couple.
Spermatozoïdes nageant dans un milieu de culture
Spermatozoïdes éjaculés
L’éjaculat est produit juste après le recueil des ovocytes. Le but de la préparation du sperme éjaculé est d’éliminer le plasma séminal et de sélectionner une population de spermatozoïdes mobiles et morphologiquement normaux. L’une des méthodes couramment utilisée est la centrifugation des spermatozoïdes auà travers d’un gradient de densité (PureSperm) : les spermatozoïdes de faible densité (morts, anormaux) ainsi que les contaminants cellulaires de l’éjaculat s’accumulent dans les fractions de densité correspondante, alors que les spermatozoïdes de plus forte densité (mobiles, normaux) traversent le gradient et se retrouvent dans le fondculot du tube. Les spermatozoïdes ainsi isolés sont lavés avec du milieu de culture afin d’éliminer toute trace de PureSperm.
Spermatozoïdes épididymaires
Les spermatozoïdes de l’épididyme peuvent être aspirés et congelés avant le cycle de traitement de la femme. Il est aussi possible que l’aspiration épididymaire se fasse le même jour que le recueil des ovocytes.
Spermatozoïdes testiculaires
La biopsie testiculaire est déchirée en petits morceaux pour permettre la libération de spermatozoïdes dans le milieu. Seuls les spermatozoïdes matures sont utilisés pour l’ICSI. A l’heure actuelle en Suisse, nous n’utilisons pas les spermatides qui sont des cellules germinales haploïdes encore immatures. La biopsie peut être prélevée avant le cycle de traitement de la femme et les spermatozoïdes congelés.
Mise en fécondation des ovocytes
La FIV - fécondation in vitro traditionnelle
Les ovocytes sont mis en présence de nombreux spermatozoïdes mobiles dont un seul va habituellement féconder l’ovocyte. Les ovocytes prélevés par ponction folliculaire sont placés individuellement ou par groupe de 2 ou 3 dans 0,5 ml de milieu de culture. Les spermatozoïdes préparés sont ajoutés aux ovocytes (50’000-100’000 spermatozoïdes mobiles/ml). Pendant les heures qui suivent, certains spermatozoïdes vont traverser le cumulus et s’attacher à la zone pellucide qui entoure l’ovocyte. La zone pellucide est une barrière importante et le spermatozoïde doit exercer des mouvements vigoureux pour la traverser. En général, un seul de ces spermatozoïdes parvient à traverser la zone pellucide, atteindre la surface de l’ovocyte et pénétrer dans l’ovocyte. Bien que la mobilité du spermatozoïde soit essentielle pour qu’il parvienne jusqu’à l’ovocyte, la morphologie du spermatozoïde semble également importante pour assurer le succès de la fécondation in vitro.
Ovocytes en contact avec des spermatozoïdes
L’ICSI - « intracytoplasmic sperm injection »
Avec cette technique, un spermatozoïde est directement injecté dans l’ovocyte à l’aide de pipettes en verre très fines. Un microscope équipé d’une excellente optique et une paire de micromanipulateurs sont nécessaires pour l’ICSI.
Technicien procédant à une ICSI
Préparation des ovocytes
Il est nécessaire que l’ovocyte soit bien visible pour permettre l’injection d’un spermatozoïde. Pour cela, les cellules du cumulus qui entourent l’ovocyte sont éliminées en utilisant une enzyme appelée hyaluronidase.
Détermination de la maturité de l’ovocyte
Seul un ovocyte mature peut être fécondé. L’ovocyte mature se trouve en métaphase de la seconde division méiotique (métaphase II) et se caractérise par la présence du 1er globule polaire dans l’espace périvitellin (entre la surface de l’ovocyte et la zone pellucide). L’ovocyte totalement immature se trouve au stade diplotène de la prophase I et présente un grand noyau appelé vésicule germinale. L’ovocyte en cours de maturation se trouve à un stade intermédiaire de la méiose; il n’a plus de vésicule germinale mais le 1er globule polaire n’est pas encore apparu. La maturation de l’ovocyte se fait dans l’ovaire en réponse à l’hCG injecté pour le «déclenchement» de l’ovulation. Elle est en général achevée lors du recueil des ovocytes mais il arrive que quelques uns des ovocytes soient encore immatures. Les ovocytes immatures représentent en général une faible proportion des ovocytes récoltés. Ces ovocytes sont laissés en culture et ne sont injectés que s’ils parviennent à maturité in vitro.
Ovocyte et son globule polaire
Sélection du spermatozoïde
Les spermatozoïdes mobiles et si possible de morphologie normale sont choisis pour être injectés. La mobilité est importante car elle signale que le spermatozoïde est vivant. Pour ralentir la vitesse de déplacement des spermatozoïdes, on ajoute du polyvinyilpyrrolidone (PVP, 10%) à la suspension juste avant usage. Une goutte (5 µl) de cette suspension est déposée sur un support et recouverte d’huile. Sous le microscope, le spermatozoïde sélectionné est immobilisé en comprimant sa queue contre le support avec la pipette d’injection et aspiré dans celle-ci, la queue en premier. L’immobilisation du spermatozoïde est nécessaire pour éviter que des lésions soient induites par les mouvements du spermatozoïde dans le cytoplasme et pour permettre l’activation de l’ovocyte.
Wednesday, August 20, 2008
Fécondation in vitro II
Les embryons sont habituellement transférés dès l'obtention des premières divisions. Au-delà, le milieu de culture utilisé pour la FIV n'est plus adéquat pour assurer leur croissance.
Le transfert peut être plus tardif et la phase de culture est prolongée cinq à six jours après la fécondation. Les embryons sont maintenus en culture jusqu'au stade blastocyste. Ces cultures prolongées nécessitent le recours à des milieux spéciaux. L'avantage du transfert au stade blastocyste est de permettre un contrôle du début de la croissance embryonnaire, stade critique du développement où surviennent de nombreux arrêts. Les blastocystes ont un meilleur taux d'implantation.
Les embryons non transférés à l'état frais peuvent être conservés par congélation, en vue d'un replacement ultérieur, à la condition toutefois qu'ils soient d'une qualité suffisante. Les embryons qui ont été préalablement congelés lors du premier transfert, sont décongelés et sélectionnés la veille ou le jour du transfert, qui a lieu selon le même protocole. Le taux d'implantations réussies après transfert d’embryons congelés est légèrement inférieur. Cependant cette technique reste intéressante, car elle permet d’augmenter le nombre de transferts (et donc les chances de grossesse) à partir d’une seule ponction.
Généralement deux à quatre embryons sont transférés dans l'utérus. En fonction de la qualité des autres embryons obtenus, ceux-ci peuvent être congelés pour un transfert ultérieur. Ceux-ci pourront être réutilisés en cas d'échec ou si les parents souhaitent avoir un autre enfant. Cette technique est appelée transfert d'embryons congelés.
Implantation
Après ce transfert, environ 12 jours sont nécessaires pour avoir l’assurance qu’une grossesse se développe. C’est en effet le temps nécessaire pour qu’apparaisse dans le sang, à concentration détectable la β-HCG, l’hormone sécrétée par l’embryon qui sert de diagnostic à la grossesse.
• Si le taux de β-HCG est nettement supérieur à 50 mUI/ml après 10 jours, c’est le signe d’un début de grossesse.
• Si le taux de βhCG est inférieur à 50 mUI/ml : il peut s’agir d’un taux résiduel d’hormones lié à la stimulation. Il convient de refaire un dosage de contrôle 48 heures plus tard afin de vérifier si le taux augmente ou au contraire diminue.
L'implantation reste l'étape limitante pour la réussite de la fécondation in vitro. Plusieurs techniques ont été testées pour essayer d'augmenter les chances de succès et ont une efficacité modérée : utilisation de gonadotrophines[3], modification mécanique de la zone pellucide entourant l'embryon[4] ou implantation multiple. L 'acupuncture pourrait être également une technique douée d'une certaine efficacité[5].
La Source : Wikipaedia
Le transfert peut être plus tardif et la phase de culture est prolongée cinq à six jours après la fécondation. Les embryons sont maintenus en culture jusqu'au stade blastocyste. Ces cultures prolongées nécessitent le recours à des milieux spéciaux. L'avantage du transfert au stade blastocyste est de permettre un contrôle du début de la croissance embryonnaire, stade critique du développement où surviennent de nombreux arrêts. Les blastocystes ont un meilleur taux d'implantation.
Les embryons non transférés à l'état frais peuvent être conservés par congélation, en vue d'un replacement ultérieur, à la condition toutefois qu'ils soient d'une qualité suffisante. Les embryons qui ont été préalablement congelés lors du premier transfert, sont décongelés et sélectionnés la veille ou le jour du transfert, qui a lieu selon le même protocole. Le taux d'implantations réussies après transfert d’embryons congelés est légèrement inférieur. Cependant cette technique reste intéressante, car elle permet d’augmenter le nombre de transferts (et donc les chances de grossesse) à partir d’une seule ponction.
Généralement deux à quatre embryons sont transférés dans l'utérus. En fonction de la qualité des autres embryons obtenus, ceux-ci peuvent être congelés pour un transfert ultérieur. Ceux-ci pourront être réutilisés en cas d'échec ou si les parents souhaitent avoir un autre enfant. Cette technique est appelée transfert d'embryons congelés.
Implantation
Après ce transfert, environ 12 jours sont nécessaires pour avoir l’assurance qu’une grossesse se développe. C’est en effet le temps nécessaire pour qu’apparaisse dans le sang, à concentration détectable la β-HCG, l’hormone sécrétée par l’embryon qui sert de diagnostic à la grossesse.
• Si le taux de β-HCG est nettement supérieur à 50 mUI/ml après 10 jours, c’est le signe d’un début de grossesse.
• Si le taux de βhCG est inférieur à 50 mUI/ml : il peut s’agir d’un taux résiduel d’hormones lié à la stimulation. Il convient de refaire un dosage de contrôle 48 heures plus tard afin de vérifier si le taux augmente ou au contraire diminue.
L'implantation reste l'étape limitante pour la réussite de la fécondation in vitro. Plusieurs techniques ont été testées pour essayer d'augmenter les chances de succès et ont une efficacité modérée : utilisation de gonadotrophines[3], modification mécanique de la zone pellucide entourant l'embryon[4] ou implantation multiple. L 'acupuncture pourrait être également une technique douée d'une certaine efficacité[5].
La Source : Wikipaedia
Tuesday, August 19, 2008
Fécondation in vitro
La fécondation in vitro (FIV) est une technique de procréation médicalement assistée et de transfert d'embryon (fivete). En 2007 alors que 15 % environ des couples ont des difficultés à faire des enfants, 2% environ des bébés des pays riches sont issus de fécondation in vitro, imaginée et mise au point dans les années 70 et opérationnelle à partir des années 1980[1].
Fécondation
Le sperme de l'homme, préparé techniquement pour améliorer la qualité spermatique, est mis en contact avec les ovocytes de la femme, dans des boîtes stériles contenant des puits. S'il y a fécondation avec apparition de pronucléi, l'embryon se développe par division cellulaire. Deux ou trois jours après le jour de la fécondation, un ou plusieurs embryons sont réimplantés dans l'utérus de la femme.La culture peut être cependant poussée jusqu'à 5 à 6 jours,où on obtient des blastocystes.
Les ovaires de la femme sont stimulés afin de provoquer la ponte de plusieurs ovules. Généralement, des injections journalières sont nécessaires, surveillées avec de multiples prises de sang, et des échographies. Des injections d'hormone permettent aussi de contrôler le déroulement de la maturation des ovocytes. Une injection destinée à accélérer le mûrissement des ovules est réalisée 36 heures avant la ponction ovocytaire. La ponction des ovocytes s'effectue généralement sous anesthésie générale légère ou locale en milieu hospitalier pour une hospitalisation inférieure à 24 heures. Le sperme est recueilli le jour de la ponction des ovocytes (quelquefois avant s'il a été congelé), il est ensuite « nettoyé » de son plasma séminal et préparé afin de récupérer les spermatozoïdes les plus mobiles et les plus typiques (normaux). Environ 100 000 spermatozoïdes sont mis en contact avec chaque ovocyte recueilli. La fécondation a lieu en une douzaine d'heures. Il est courant d'obtenir de 5 à 6 embryons en moyenne, bien que ce nombre puisse aller jusqu'à une trentaine. Les embryons sont mis en culture de 48 heures à 6 jours.
Les embryons sont classés en fonction de leur qualité cellulaire, à savoir: leur nombre de cellules, leur régularité (tailles de cellules différentes ou non), et de leur fragmentation. Les embryons utilisés en priorité sont ceux dont la chronologie de la division cellulaire est respectée, avec des cellules bien régulières et sans fragmentation, car ils donnent les meilleures chances de grossesse. Les embryons sont très irréguliers.
Fécondation
Le sperme de l'homme, préparé techniquement pour améliorer la qualité spermatique, est mis en contact avec les ovocytes de la femme, dans des boîtes stériles contenant des puits. S'il y a fécondation avec apparition de pronucléi, l'embryon se développe par division cellulaire. Deux ou trois jours après le jour de la fécondation, un ou plusieurs embryons sont réimplantés dans l'utérus de la femme.La culture peut être cependant poussée jusqu'à 5 à 6 jours,où on obtient des blastocystes.
Les ovaires de la femme sont stimulés afin de provoquer la ponte de plusieurs ovules. Généralement, des injections journalières sont nécessaires, surveillées avec de multiples prises de sang, et des échographies. Des injections d'hormone permettent aussi de contrôler le déroulement de la maturation des ovocytes. Une injection destinée à accélérer le mûrissement des ovules est réalisée 36 heures avant la ponction ovocytaire. La ponction des ovocytes s'effectue généralement sous anesthésie générale légère ou locale en milieu hospitalier pour une hospitalisation inférieure à 24 heures. Le sperme est recueilli le jour de la ponction des ovocytes (quelquefois avant s'il a été congelé), il est ensuite « nettoyé » de son plasma séminal et préparé afin de récupérer les spermatozoïdes les plus mobiles et les plus typiques (normaux). Environ 100 000 spermatozoïdes sont mis en contact avec chaque ovocyte recueilli. La fécondation a lieu en une douzaine d'heures. Il est courant d'obtenir de 5 à 6 embryons en moyenne, bien que ce nombre puisse aller jusqu'à une trentaine. Les embryons sont mis en culture de 48 heures à 6 jours.
Les embryons sont classés en fonction de leur qualité cellulaire, à savoir: leur nombre de cellules, leur régularité (tailles de cellules différentes ou non), et de leur fragmentation. Les embryons utilisés en priorité sont ceux dont la chronologie de la division cellulaire est respectée, avec des cellules bien régulières et sans fragmentation, car ils donnent les meilleures chances de grossesse. Les embryons sont très irréguliers.
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